【基因工程的基本操作 程序】

教材梳理：

基因工程的基本操作步骤为四步曲：目的基因的获取;基因表达载体的构建;将目的基因导入受体细胞;目的基因的检测与鉴定。

一.目的基因的获取

1.目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因。

2.目的基因的获取方法：

注:需要重点复习的内容有：a基因组文库与部分基因文库的含义及区别；建立基因文库的目的；如何从基因文库中获取目的基因； b逆转录法的过程 ，c PCR技术(原理、场所、条件、过程、特点)DNA复制与PCR技术列表比较。如下所示：

(1)从基因文库中获取

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。

构建基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。

基因组文库：含有一种生物的所有基因。

部分基因文库(如cDNA文库)：含部分基因，可由mRNA反转录而来。

(2)利用PCR技术扩增目的基因

PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

原理：DNA双链复制

原料：模板DNA;RNA引物;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶(Taq酶);

方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。

过程：热变性(90-95℃ )、退火(55-60℃)、延伸(70-75℃)。

特点：指数形式扩增

二.基因表达载体的构建(基因工程的核心—体外进行)

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在;可以遗传给下一代;使目的基因能够表达和发挥作用。

3.方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。

目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)

4.条件：同种限制酶、DNA连接酶、(目的基因、启动子、终止子、标记基因)

三.将目的基因导入受体细胞

转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

①导入植物细胞：常用农杆菌转化法(将构建的载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞)，基因枪法、花粉管通道法。

②导入动物细胞：显微注射法(将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中)

③导入微生物细胞：Ca2+处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。

提示：农杆菌转化法的原理是利用农杆菌(胞内寄生菌)对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。

四.目的基因的检测和鉴定

分子检测：导入检测+表达检测

①导入检测：利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。

②表达检测：目的为了检测是否转录出了mRNA，利用DNA-mRNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。

③表达检测：目的为了检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原-抗体杂交，看是否有杂交带。

个体水平的鉴定：进行抗虫、抗病的接种实验，根据其性状判断是否 91exam.org表达。

提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交;②抗原-抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的